giovedì 16 maggio 2013

Alternativi? No, scientifici!

Cosa offrire alla ricerca al posto della vivisezione? Quali sono i metodi alternativi? Queste sono tra le domande poste più frequentemente agli anti-vivisezionisti.

La sperimentazione sugli animali è una metodologia errata e inaffidabile che, in quanto tale, andrebbe abolita comunque. A maggior ragione oggi che le conoscenze scientifiche offrono molte opportunità che non richiedono il sacrificio di esseri viventi.
Una breve panoramica sulle metodologie che sostituiscono l’uso di animali

Negli anni 1989-2002, circa 50 laboratori nel mondo hanno testato, sviluppato e valutato più di 150 nuove metodologie per l’analisi di sostanze chimiche con effetto sconosciuto per l’uomo: metodi matematico-informatici, chimici e biologici.
In questo dossier concentreremo l’attenzione sui metodi chimici e biologi, i metodi matematico-informatici verranno approfonditi nel prossimo dossier.
I metodi sostitutivi più famosi utilizzano colture di organismi unicellulari (procarioti), cellule, tessuti e organi isolati. Tutto il materiale di origine umana può essere recuperato con estrema facilità soprattutto da biopsie e da scarti chirurgici.
I vantaggi, comuni a tutti i seguenti metodi, sono: la scientificità, la rapidità, il basso costo, la possibilità di testare non solo la singola sostanza ma anche l'insieme e le interferenze di più composti contemporaneamente, la riproducibilità dei risultati ottenuti sia all'interno dello stesso laboratorio sia in laboratori diversi.

Metodi chimici

Corrositex - In questo test la sostanza potenzialmente corrosiva da esaminare viene messa in una fiala contenente un tessuto artificiale di consistenza gelatinosa dello spessore di 3 centimetri. Più una sostanza è corrosiva più in fretta distruggerà questa membrana e, alcuni rilevatori chimici posti sotto di essa, segnaleranno la fine della prova. Il tessuto artificiale può essere modificato per simulare qualsiasi tipo di pelle.

Solatex-PI - La foto-irritazione è uno degli effetti tossici che si possono verificare quando una sostanza chimica, assorbendo i raggi ultravioletti della luce, danneggia la pelle. Il test SOLATEX-PI permette lo studio della capacità di creare foto-irritazione di queste sostanze.
Gli effetti tossici di foto-irritazione avvengono quando la luce interagisce con la sostanza creando una serie di reazioni chimiche (reazioni di ossidoriduzione, formazione di radicali liberi e successiva interazione con la pelle); il sistema SOLATEX-PI utilizza una speciale membrana e una serie di composti chimici che possono reagire e "indicare" se stanno avvenendo le reazioni pericolose.

Metodi Biologici

Test di Ames - Il fondamento scientifico che ha permesso la creazione, e i successivi miglioramenti, di questo test è la capacità di molti carcinogeni di generare centri elettrofili che si legano al DNA cellulare. In pratica, per sapere se una sostanza è potenzialmente cancerogena o teratogena (se può dare, cioè, azione mutagena), viene messa a contatto con ceppi di batteri (Salmonella typhimurium) in un apposito terreno di coltura. Viene usata una varietà del batterio appositamente modificata che, per crescere, non ha bisogno di una particolare molecola, l’Istidina. Se la sostanza testata è mutagena modifica il batterio e gli ricrea il bisogno di Istidina.

Test di Bettero - Questo test viene utilizzato per testare sostanze potenzialmente irritanti per l’occhio. La prova viene eseguita sulla lacrima umana che, in condizioni normali, contiene mediatori chimici (Istamina, Serotonina, Leucotrene 4, ecc...) dell'infiammazione solo in piccole quantità. La sostanza in esame viene posta a contatto con la lacrima umana: se la sostanza è un irritante di qualsiasi genere il numero di mediatori chimici aumenta rapidamente. In questo modo si può determinare con estrema facilità e precisione la forza irritante di una sostanza.

Microtox - Il test consiste nel mettere a contatto con la sostanza da analizzare, che può essere liquida o solida, un ceppo di batteri marini (Photobacterium phosphoreum) che presentano una luminescenza naturale. La luce emessa è il risultato di un processo metabolico naturale delle cellule; in pratica, questa luminescenza, riflette il loro stato di vita. Una sostanza tossica inibisce il metabolismo cellulare e fa diminuire la luminescenza in misura proporzionale alla propria concentrazione. Esiste anche una variante di questo metodo che fa uso di un mutante naturale del Vibrio Fischeri. Con questa recentissima metodologia è possibile rilevare la presenza di sostanze mutagene. Questo mutante naturale non è luminoso ma, se viene a contatto con una sostanza mutagena, subisce una variazione e lo diventa.

Colture di epatociti - Questa metodologia è particolarmente importante perché gran parte delle trasformazioni chimiche che una sostanza subisce quando entra in contatto con un organismo avviene, nell'uomo, proprio nel fegato. Gli epatociti (colture di cellule di fegato umano) possono essere usati, in farmacologia e in tossicologia per diversi studi; i principali sono i seguenti:
Studi di biotrasformazione – Per studiare le modifiche che una sostanza chimica subisce all’interno dell’organismo e i metaboliti che si formano.
Studi tossicologici – Per valutare la tossicità sia della sostanza sia delle sue trasformazioni all’interno dell’organismo.
Studi meccanicistici Epatociti isolati offrono la possibilità di studiare, in dettaglio, i meccanismi con cui avvengono le azioni biologiche.
Studi biocinetici gli epatociti sono un insostituibile metodo per studiare il trasporto delle sostanze a livello cellulare.

Lactate Dehydrogenase (LDH) release - L'enzima LDH può essere usato come indicatore della distruzione della membrana cellulare. Gli effetti di sostanze chimiche a contatto con colture cellulari o tissutali si possono valutare misurando la quantità di LDH nell'ambiente di reazione. Più la sostanza chimica distrugge le membrane cellulari maggiore sarà la quantità di LDH rilasciata nell'ambiente di reazione.

Neutral Red Uptake (NRU) - L'NRU è un test di citotossicità usato per identificare il numero di cellule rimaste vive dopo esposizione ad una sostanza chimica. Si basa sulla capacità di assorbimento, da parte delle cellule vive e intatte, del colorante NR; le cellule uccise dalla sostanza chimica non saranno invece in grado di assorbire il colorante.

Neutral Red Release - L'NRR è un test di citotossicità in grado di misurare il danno causato da una sostanza chimica alla membrana cellulare. Le cellule trattate precendentemente con il colorante NR, vengono esposte ad alte dosi della sostanza in esame per brevi periodi di tempo. Se la membrana cellulare viene attaccata e distrutta rilascia il colorante nell'ambiente di reazione.

Total Protein Content (TPC) - Il più famoso dei test citotossicologici usato per identificare l'inibizione della crescita cellulare è probabilmente il TPC: con questo metodo una sostanza chimica viene posta a contatto con una coltura di cellule in crescita esponenziale e viene successivamente misurato il contenuto totale di proteine.

MTT Test - Un test citotossicologico poco conosciuto ma estremamente valido è l'MTT Test. Come l'NRU, anche l'MTT serve per valutare la diminuzione di vitalità delle cellule a contatto con una sostanza chimica. Se le cellule sono vive, sono in grado di ridurre chimicamente il colorante MTT.

Inibizione del legame delle cellule tumorali (ITC) - Il test ITC ha dimostrato di essere in grado di identificare sostanze potenzialmente teratogene; infatti, in presenza di queste sostanze, risulta inibito il legame di cellule tumorali ad una superficie di plastica trattata con Concanavalina A. Con questo saggio è inoltre possibile valutare se il danno, che la sostanza in esame può causare, riguarda la struttura della membrana oppure le sue funzioni.


Confronto tra le tradizionali prove su animali e le metodologie sostitutive






Il principale e più recente confronto tra i classici test su animali (LD50) e le metodologie sostitutive è stato eseguito dal Centro di Ricerca Svedese MEIC (Multicenter Evaluation of In Vitro Toxicology) all’interno del Progetto Internazionale EDIT.
In questo studio, i risultati ottenuti con ognuna delle diverse metodologie per la valutazione della tossicità sono stati confrontati con le reali tossicità riscontrate nell’uomo per le medesime sostanze.
In questo modo è stato possibile valutare quali siano i metodi che meglio predicono la reale pericolosità per l’uomo delle varie sostanze chimiche.
Sono state scelte le più promettenti metodologie alternative (circa 60) fra le colture cellulari umane e il confronto tra i risultati ottenuti nell’uomo, negli animali e con le colture cellulari è stato effettuato utilizzando le più avanzate metodologie informatiche.

Sono stati ottenuti i seguenti risultati:
  • Le prove su animali, effettuate su topi e ratti che sono in assoluto le specie animali più utilizzate, hanno mostrato una capacità predittiva molto modesta della dose letale per l’uomo (Indice di predittività Q2 = 0.64)
  • I risultati migliori, più predittivi della dose letale per l'uomo, sono stati ottenuti tramite una serie di 3 colture cellulari di cellule umane (Indice di predittività Q2 = 0.76-0.82)
  • Le 3 colture cellulari sono:

Hep G2 che misura l'influenza della sostanza da testare sul contenuto proteico (durata del test = 24 ore)

HL-60 che misura l'influenza della sostanza da testare sul contenuto di ATP (durata del test = 24 ore)

Chang Liver che misura le variazioni della morfologia (24 ore) e del pH (7 giorni).

Questa serie di tre metodologie risulta essere, oltre che più predittiva, anche più rapida ed economica delle tradizionali prove su animali.

Questi risultati non implicano che le altre metodologie alternative non siano valide, ma solo che, per questo obiettivo specifico, esiste la possibilità di sostituire le attuali metodologie utilizzate per valutare la tossicità di una sostanza con nuovi metodi decisamente più predittivi e, di conseguenza, tutelare in maniera migliore la salute dei cittadini.

Bisogna inoltre notare che questa serie di tre colture cellulari si è rivelata più predittiva rispetto ai «migliori» risultati ottenuti sugli animali.
Non sono stati infatti considerati, in questo studio, i pareri di altri ricercatori che hanno già fortemente criticato la validità stessa del test LD-50.
Il progetto MEIC-EDIT prosegue con approfondimenti nello studio di:

* Tossicità in vitro con dosaggi ripetuti
* Informazioni sul meccanismo di reazione della distruzione delle proteine, danneggiamento della morfologia cellulare, differenze fra tossicità acute con altre dosi e tossicità croniche con basse dosi, tossicità delle cellule aerobiche.
* Test in vitro di recettori specifici particolarmente importanti nella tossicità umana.
* Reversibilità della tossicità cellulare.
* Test in vitro sul passaggio della barriera sangue-cervello.
* Test in vitro per l’assorbimento nel tratto intestinale.
* Test in vitro sui legami proteici.
* Test in vitro per studiare come si modificano le sostanze all’interno dell’organismo e come da queste trasformazioni possano generarsi nuove molecole più tossiche delle sostanze originali.

Perché non vengono utilizzati obbligatoriamente per legge questi metodi sostitutivi invece dei tradizionali test con animali?
Non si spiega l’utilizzo di animali per ottenere risultati utili all’uomo se non per i seguenti due motivi:

Pigrizia mentale: chi sperimenta su animali è abituato alla comodità di questa pratica che raramente viene messa in discussione e che offre facili opportunità di pubblicazioni. È l’emblema di quella parte del mondo scientifico che non ama rimettersi in discussione o che impara solo dalle vecchie esperienze senza valutarne obiettivamente risultati positivi e fallimenti. Questo purtroppo vale anche per molti docenti universitari che hanno studiato su testi e in atenei dove la sperimentazione sugli animali è considerata attendibile e quindi trasmettono ai loro studenti queste conoscenze acquisite in passato. Ma la ricerca scientifica deve essere in costante evoluzione e non fermarsi a modelli così discutibili.









Vantaggio economico: la sperimentazione su animali facilita la commercializzazione di una sostanza: i test su animali vengono ancora utilizzati per creare la confusione necessaria per evitare regolamentazioni migliori e più sicure per la salvaguardia dell’uomo e dell’ambiente ed è evidente il vantaggio per le aziende. Se poi una sostanza si rivela dannosa per l’uomo (è il caso di molti farmaci cha hanno causato gravi malformazioni, tumori o altri importanti effetti collaterali), può essere ritirata dal commercio (a volte senza nemmeno grande enfasi) ed è difficile denunciare e punire l’azienda che l’ha commercializzata e che ha eseguito tutti i test sugli animali previsti dalla legge.


I test con animali permettono alle aziende di ottenere risultati NON estrapolabili all’uomo con sicurezza e quindi evitano regolamentazioni più severe per la commercializzazione. Se una sostanza è innocua per l’animale viene provata sull’uomo. Se è tossica per l’animale, dato che potrebbe non esserlo per l’uomo, viene comunque provata sull’uomo. L’animale non fa più da filtro delle nuove sostanze e di conseguenza, usando animali, è teoricamente possibile riuscire a vendere qualsiasi prodotto. Un metodo scientifico che dimostra la pericolosità di un prodotto per l’uomo bloccherebbe immediatamente la vendita dello stesso. Ecco perché non vengono utilizzati questi metodi alternativi.
Dossier pubblicato su Orizzonti Nr. 95 - giugno 2003




































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